Filter fluoresensi adalah komponen penting dalam mikroskop fluoresensi.Sistem tipikal memiliki tiga filter dasar: filter eksitasi, filter emisi, dan cermin dichroic.Mereka biasanya dikemas dalam sebuah kubus sehingga kelompoknya dimasukkan bersama ke dalam mikroskop.
Bagaimana cara kerja filter fluoresensi?
Filter Eksitasi
Filter eksitasi mentransmisikan cahaya dengan panjang gelombang tertentu dan memblokir panjang gelombang lainnya.Mereka dapat digunakan untuk menghasilkan warna berbeda dengan menyetel filter agar hanya memungkinkan satu warna yang masuk.Filter eksitasi hadir dalam dua tipe utama — filter lolos panjang dan filter lolos pita.Exciter biasanya berupa filter bandpass yang hanya melewatkan panjang gelombang yang diserap oleh fluorofor, sehingga meminimalkan eksitasi sumber fluoresensi lain dan menghalangi cahaya eksitasi pada pita emisi fluoresensi.Seperti yang ditunjukkan oleh garis biru pada gambar, BP adalah 460-495 yang berarti hanya dapat melewati fluoresensi 460-495nm.
Itu ditempatkan dalam jalur iluminasi mikroskop fluoresensi dan menyaring semua panjang gelombang sumber cahaya kecuali rentang eksitasi fluorofor.Transmisi minimum filter menentukan kecerahan dan kecemerlangan gambar.Direkomendasikan minimal transmisi 40% untuk filter eksitasi sehingga transmisi idealnya >85%.Bandwidth filter eksitasi harus seluruhnya berada dalam rentang eksitasi fluorofor sehingga panjang gelombang pusat (CWL) filter sedekat mungkin dengan panjang gelombang eksitasi puncak fluorofor.Kepadatan optik (OD) filter eksitasi menentukan kegelapan gambar latar belakang;OD adalah ukuran seberapa baik filter memblokir panjang gelombang di luar jangkauan transmisi atau bandwidth.Disarankan OD minimum 3,0 tetapi OD 6,0 atau lebih tinggi adalah yang ideal.
Filter Emisi
Filter emisi berfungsi untuk memungkinkan fluoresensi yang diinginkan dari sampel mencapai detektor.Mereka memblokir panjang gelombang yang lebih pendek dan memiliki transmisi tinggi untuk panjang gelombang yang lebih panjang.Jenis filter juga dikaitkan dengan angka, misalnya BA510IF pada gambar (filter penghalang interferensi), sebutan tersebut mengacu pada panjang gelombang pada 50% transmisi maksimumnya.
Rekomendasi yang sama untuk filter eksitasi juga berlaku untuk filter emisi: transmisi minimum, bandwidth, OD, dan CWL.Filter emisi dengan kombinasi CWL, transmisi minimum, dan OD yang ideal memberikan gambar paling terang, dengan pemblokiran sedalam mungkin, dan memastikan deteksi sinyal emisi paling samar.
Cermin Dikroik
Cermin dichroic ditempatkan di antara filter eksitasi dan filter emisi pada sudut 45° dan memantulkan sinyal eksitasi ke arah fluorofor sambil mentransmisikan sinyal emisi ke detektor.Filter dichroic dan beam splitter yang ideal memiliki transisi yang tajam antara refleksi maksimum dan transmisi maksimum, dengan refleksi >95% untuk bandwidth filter eksitasi dan transmisi >90% untuk bandwidth filter emisi.Pilih filter dengan mempertimbangkan panjang gelombang perpotongan (λ) fluorofor, untuk meminimalkan cahaya liar dan memaksimalkan rasio signal-to-noise gambar fluoresen.
Cermin dichroic pada gambar ini adalah DM505, dinamakan demikian karena 505 nanometer adalah panjang gelombang pada 50% transmisi maksimum untuk cermin ini.Kurva transmisi untuk cermin ini menunjukkan transmisi tinggi di atas 505 nm, penurunan tajam pada transmisi di sebelah kiri sebesar 505 nanometer, dan reflektifitas maksimum di sebelah kiri sebesar 505 nanometer namun masih mungkin terdapat beberapa transmisi di bawah 505 nm.
Apa perbedaan antara filter long pass dan band pass?
Filter fluoresensi dapat dibagi menjadi dua jenis: long pass (LP) dan band pass (BP).
Filter lolos panjang mentransmisikan panjang gelombang yang panjang dan memblokir gelombang yang lebih pendek.Panjang gelombang cut-on adalah nilai pada 50% transmisi puncak, dan semua panjang gelombang di atas cut-on ditransmisikan oleh filter lolos panjang.Mereka sering digunakan pada cermin dichroic dan filter emisi.Filter longpass harus digunakan ketika penerapannya memerlukan pengumpulan emisi maksimum dan ketika diskriminasi spektral tidak diinginkan atau diperlukan, yang umumnya terjadi pada probe yang menghasilkan spesies emisi tunggal dalam spesimen dengan tingkat autofluoresensi latar belakang yang relatif rendah.
Filter pass band hanya mentransmisikan pita panjang gelombang tertentu, dan memblokir pita lainnya.Mereka mengurangi crosstalk dengan hanya mengizinkan bagian terkuat dari spektrum emisi fluorofor yang ditransmisikan, mengurangi kebisingan autofluoresensi dan dengan demikian meningkatkan rasio signal-to-noise dalam sampel autofluoresensi latar belakang tinggi, yang tidak dapat ditawarkan oleh filter lolos panjang.
Berapa banyak jenis set filter fluoresensi yang dapat disediakan BestScope?
Beberapa jenis filter yang umum termasuk filter biru, hijau, dan ultraviolet.Seperti yang ditunjukkan pada tabel.
| Kumpulan Filter | Filter Eksitasi | Cermin Dikroik | Filter Penghalang | Lampu LED Panjang Gelombang | Aplikasi |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485nm | ·FITC: Metode antibodi fluoresen ·Oranye asam: DNA, RNA ·Auramine: basil tuberkel ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535nm | ·Rhodamine, TRITC: Metode antibodi fluoresen ·Propidium iodida: DNA ·RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365 nm | ·Pengamatan fluoresensi otomatis ·DAPI: pewarnaan DNA ·Hoechest 332528, 33342: digunakan untuk pewarnaan Kromosom |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405 nm | ·Katekolamin ·5-hidroksi triptamin ·Tetrasiklin: Kerangka, Gigi |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640 nm | ·Cy5 ·Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Set filter yang digunakan dalam akuisisi fluoresensi dirancang berdasarkan panjang gelombang utama yang digunakan dalam aplikasi fluoresensi, yang didasarkan pada fluorofor yang paling sering digunakan.Karena alasan ini, mereka juga diberi nama sesuai dengan fluorofor yang dimaksudkan untuk pencitraan, seperti kubus filter DAPI (biru), FITC (hijau) atau TRITC (merah).
| Kumpulan Filter | Filter Eksitasi | Cermin Dikroik | Filter Penghalang | Lampu LED Panjang Gelombang |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365 nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535nm |
| FL-Auramine | BP470 | DM480 | BA485 | 450 nm |
| Texas Merah | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560 nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560 nm |
Bagaimana Anda memilih filter fluoresensi?
1. Prinsip pemilihan filter fluoresensi adalah membiarkan cahaya fluoresensi/emisi melewati ujung pencitraan sejauh mungkin, dan pada saat yang sama memblokir cahaya eksitasi sepenuhnya, untuk mendapatkan rasio sinyal terhadap kebisingan tertinggi.Khusus untuk penerapan eksitasi multifoton dan mikroskop refleksi internal total, noise yang lemah juga akan menyebabkan interferensi yang besar pada efek pencitraan, sehingga persyaratan rasio sinyal terhadap noise lebih tinggi.
2. Mengetahui spektrum eksitasi dan emisi fluorofor.Untuk membuat rangkaian filter fluoresensi yang menghasilkan gambar berkualitas tinggi dan kontras tinggi dengan latar belakang hitam, filter eksitasi dan emisi harus mencapai transmisi tinggi dengan riak pita sandi minimal di wilayah yang sesuai dengan puncak atau emisi eksitasi fluorofor.
3. Pertimbangkan ketahanan filter fluoresensi.Filter ini harus tahan terhadap sumber cahaya intens yang menghasilkan sinar ultraviolet (UV) yang dapat menyebabkan “burnout”, terutama pada filter eksiter karena terkena intensitas penuh dari sumber penerangan.
Gambar Sampel Fluoresen Berbeda
Sumber daya dikumpulkan dan diatur di Internet, dan hanya digunakan untuk pembelajaran dan komunikasi.Jika ada pelanggaran, silakan hubungi kami untuk menghapus.
Waktu posting: 09 Des-2022